江西省地方太阳城
DB36/T 1415—2021
猕猴桃雌雄种质分子身份证鉴定技术规程
Identification of male and female germplasm of Actinidia by molecular identity card
2021 - 06 - 30 发布 2022 - 01 - 01 实施
江西省市场监督管理局 发布
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《太阳城 化工作导则 第1部分：太阳城 化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由江西省农业农村厅提出并归口。
本文件主要起草单位：江西农业大学。
本文件主要起草人：廖光联、徐小彪、黄春辉、钟敏、贾东峰、曲雪艳、吴茵、涂贵庆、朱壹、魏清江、辜青青、陈明。
1 范围
本文件规定了分子身份证鉴定猕猴桃（Actinidia）雌雄种质的术语和定义、原理、试剂与试药、
仪器设备、检测及构建分子身份证方法。
本文件适用于猕猴桃雌雄种质鉴定与分子身份证构建。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文
件。
NY/T 3639 中华猕猴桃品种鉴定 SSR分子标记法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
分子身份证 identity card
以特异性引物为探针，同猕猴桃细胞核DNA的酶切片段杂交，可以获得由多个位点上的等位基因组
成的长度不等的杂交带，人为将同一位置条带在不同物种上的有无标记为1/0，构建成数字矩阵，同一
物种间极少有两个品种（系）完全相同，故称为特异性分子身份证。
3.2
相似度 similarity
供试品种分子身份证与对照分子身份证相似的程度。
4 原理
利用CTAB法提取植株叶片DNA，与特异性引物混合后进行PCR仪扩增，并在丙烯酰胺凝胶进行分离和
显现，采用人工读取条带的方式绘制1/0矩阵，构建成DNA分子身份证，最后统计供试品种和对照品种的
相似度，根据相似度鉴别猕猴桃种质的真伪。
5 试剂与试药
主要试剂与试药见附录A。
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6 仪器设备
主要仪器设备见附录B。
7 操作步骤
7.1 样品制备
参照NY/T 3639执行。
7.2 DNA 的提取
7.2.1 准备工作
水浴锅水浴加热至65℃，预热3%裂解液、洗液，两种液体使用前均需加入2%体积的β-巯基乙醇
（V/V）；-20℃预冷无水乙醇和75%乙醇（现配后预冷）。
7.2.2 称样
称取0.10 g新鲜/硅胶干燥后的叶片样品于2 mL管子，磨样机磨成粉状。
7.2.3 第一次洗涤
硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。向2mL管子中加入1 mL洗液，充分混匀，65℃水浴30
min，中间轻摇数次，使其充分混匀；随后10000 rpm/min 离心5 min。
7.2.4 第二次洗涤
硅胶干燥后的叶片样品需要进行的步骤。弃上清液，向2 mL管子中加入1 mL洗液，充分混匀，65
℃水浴30 min，中间轻摇数次，使其充分混匀；随后10000 rpm/min 离心5 min。
7.2.5 裂解
弃上清液，向2 mL管子中加入1 mL CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1 h以上，中间轻摇数次，使
其充分混匀；冷却至室温，随后12000 rpm/min 离心10 min。
7.2.6 第一次抽提
取上清液（可0.80 mL）于新的2 mL管子中，加入等体积抽提液1，摇床混匀10 min，随后12000
rpm/min离心10 min。
7.2.7 第二次抽提
取上清液（可0.60 mL）于新的2 mL管子中，加入等体积抽提液2，摇床混匀10 min，随后12000
rpm/min离心10 min。
7.2.8 沉淀
取上清液（可0.50 mL）于新的1.50 mL管子中，加入1/10体积NaAC，2.50倍体积的预冷的无水乙醇，
-20℃沉淀30 min以上，随后4℃，10000 r rpm/min离心8 min。此步骤肉眼可见沉淀。
7.2.9 漂洗
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弃上清液，加入1 mL 75%无水乙醇，沉淀30 min。每隔30 min漂洗一次，共漂洗4次。
7.2.10 干燥
打开盖子放入旋蒸仪，设定DAL模式，30℃，8 min，干燥至无液体即可（避免乙醇影响后续PCR），
不可过度干燥。
7.2.11 溶解
往每个管子中加入60 μL RNA溶解酶（按RNase:TE缓冲液=3 μl:1000 μl配制）。4℃放置过夜后用
超微分光光度计测定DNA质量。OD260/OD280的值在1.80～2.00时，表明DNA的纯度较好。测定后用TE缓
冲液将DNA含量稀释至150 ng/μl。
7.3 PCR 扩增
7.3.1 特异性引物
选用猕猴桃雌雄种质特异性引物（附录C、附录D）进行PCR扩增。
7.3.2 扩增反应体系
包含2×Taq PCR Mix 5 μL；上下游引物各0.80 μl；模板DNA 1 μl；双蒸水2.40 μl。
7.3.3 扩增程序
94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃～62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共28个～34个循环，最
后72℃延伸10 min于12℃保存。
7.4 丙烯酰胺凝胶电泳
7.4.1 制胶
按顺序往150 mL烧杯加入双蒸水60 mL、5X TBE 20 mL、40%聚丙烯酰胺20 mL、APS 864 μL、TEMED
76 μL，搅拌均匀后灌入DNA序列分析电泳仪玻璃板中，排气泡后插入梳齿，凝固1 h后进行下一步。
7.4.2 点样
拔出梳齿，用移液枪移取1 μL PCR扩增产物，点入梳齿孔中；同时点入500 bp DNA marker及10 X
Loading Buffer。
7.4.3 跑胶
使用仪器为DYCZ-20G型DNA序列分析电泳仪，先50 V电压跑30 min，随后调为200 V，待10 X Loading
Buffer 跑到接近玻璃板底部时结束。
7.4.4 染色
采用快速银染法，将丙烯酰胺凝胶取下放入硝酸银溶液，浸染10 min。
7.4.5 显影
从银染液中取出凝胶，用双蒸水冲洗干净后，放入显影液中显影，待条带全部显出，转入到清水
中。
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8 结果记录与判定
8.1 结果记录
拍照记录并统计清晰的SSR条带，采用人工读带的方法，在Microsoft Excel中以二进制读带方式记
录引物扩增的结果，同一位点上具有相同迁移率的条带记为1，无带记为0，记录位点位置（见附录E、
附录F）。
8.2 构建分子身份证
利用同一样品的不同引物条带读数绘制成1/0矩阵，构建成该品种的特异性分子身份证，如附录
E、附录F所示。
8.3 判定
根据相似度进行结果判定，相似度=（同一位点读数相同的数量/总位点数）*100%，相似度等于或
大于99%，即可判定为在分子水平上是同一个样品。